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Difference in neutralizing antibodies percentages against SARS-CoV-2 in vaccinated breastfeeding women\'s milk and blood

Diferencia en los porcentajes de anticuerpos neutralizantes contra el SARS-CoV-2 en la leche y la sangre de mujeres lactantes vacunadas

Diferença no percentual de anticorpos neutralizantes contra o SARS-CoV-2 no leite e no sangue de lactantes imunizadas


Fernanda Mazzoli (Autora correspondente / Autor para correspondência / Corresponding author)
Programa de Pós-Graduação em Saúde da Mulher e da Criança. Instituto Nacional de Saúde da Mulher, da Criança e do Adolescente Fernandes Figueira, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Telefone: (21) 99824-3284
e-mail: femazzoli@gmail.com / ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9495-3870

Ianne Stéfani Angelim Vieira
Programa de Pós-Graduação em Saúde da Mulher e da Criança. Instituto Nacional de Saúde da Mulher, da Criança e do Adolescente Fernandes Figueira, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
e-mail: iannevieira.enf@gmail.com / ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9987-8651

Ana Carolina Carioca da Costa
Unidade de Pesquisa Clínica, Instituto Nacional de Saúde da Mulher, da Criança e do Adolescente Fernandes Figueira, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
e-mail: carol.carioca@gmail.com / ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9456-3319

Maria Célia Chaves Zuma
Unidade de Pesquisa Clínica, Instituto Nacional de Saúde da Mulher, da Criança e do Adolescente Fernandes Figueira, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
e-mail: celiaczuma@gmail.com / ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8193-8268

Zilton Faria Meira de Vasconcelos
Unidade de Pesquisa Clínica, Instituto Nacional de Saúde da Mulher, da Criança e do Adolescente Fernandes Figueira, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
e-mail: zvasconcelos@gmail.com / ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2193-2224

Paolla Beatriz de Almeida Pinto
Laboratório de Biotecnologia e Fisiologia de Infecções Virais, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
e-mail: paollabap@gmail.com / ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7994-7226

Ada Maria de Barcelos Alves
Laboratório de Biotecnologia e Fisiologia de Infecções Virais, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
e-mail: adambalves@gmail.com / ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5487-4032

Simone Morais da Costa
Laboratório de Biotecnologia e Fisiologia de Infecções Virais, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
e-mail: simonemc@hotmail.com / ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0846-4729

Maria Elisabeth Lopes Moreira
Unidade de Pesquisa Clínica, Instituto Nacional de Saúde da Mulher, da Criança e do Adolescente Fernandes Figueira, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
e-mail: bebethiff@gmail.com / ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2034-0294

Daniele Marano
(Daniele Marano Rocha de Albuquerque)
Unidade de Pesquisa Clínica, Instituto Nacional de Saúde da Mulher, da Criança e do Adolescente Fernandes Figueira, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
e-mail: danielemarano@yahoo.com.br / ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6985-941X

ABSTRACT
Objective: To compare the percentage of antibodies with neutralizing potential to Wuhan and Omicron variants in the milk and blood of lactating women immunized for SARS-CoV-2 based on the number of doses, vaccine technologies used. Methods: Cross-sectional study conducted in 2022 with 214 lactating women vaccinated for COVID-19 with mRNA, non-replicating viral vector or inactivated whole virus vaccines. Data gathered via standardized questionnaire, and samples of breast milk and blood. Antibodies detected by the ELISA method. A significance level of 5% was considered. Results: Blood had higher neutralizing antibodies percentage than milk for Wuhan (blood-91·3%/milk-23·1%) and Omicron (blood-83·7%/milk-15·2%) variants. Women receiving three or more doses had higher blood antibody percentages for Wuhan (median=91·9%) and Omicron (median=86·0%) variants. In milk, no disparity in the percentage of antibodies was found, but the probability of antibodies\' presence was higher than in blood for both variants. Vaccine technologies led to significant differences in the presence of antibodies in milk but not in blood over time for Omicron variant. No difference was observed for Wuhan variant. Conclusion: Protection conferred by antibodies present in milk lasted longer than in blood.
Keywords: COVID-19, Human milk, Vaccine, Antibodies, Neutralizing antibodies.

RESUMEN
Objetivo: Comparar el porcentaje de anticuerpos neutralizantes frente a las variantes Wuhan y Omicron en la leche y la sangre de lactantes inmunizados contra el SRAS-CoV-2 en función del número de dosis y las tecnologías vacunales utilizadas. Métodos: Estudio transversal realizado en 2022 con 214 mujeres lactantes inmunizadas contra COVID-19 con vacunas de ARNm, vector viral no replicante o virus completo inactivado. Datos recolectados mediante cuestionario estandarizado y muestras de leche materna y sangre. Anticuerpos detectados por el método ELISA. Se consideró un nivel de significación del 5%.
Resultados: El porcentaje de anticuerpos fue mayor en sangre que en leche para las variantes Wuhan (sangre-91-3%/leche-23-1%) y Omicron (sangre-83-7%/leche-15-2%). Entre las mujeres que recibieron tres o más dosis, la sangre mostró porcentajes más elevados para las variantes Wuhan (mediana=91-9%) y Omicron (mediana=86-0%). En la leche, aunque no se encontró disparidad en el porcentaje de anticuerpos, la probabilidad de que hubiera anticuerpos fue mayor que en la sangre para ambas variantes. Las tecnologías de vacunas dieron lugar a diferencias significativas en la presencia de anticuerpos en la leche, pero no en la sangre a lo largo del tiempo para la variante Omicron. No se observaron diferencias en el caso de la variante Wuhan. Conclusión: La protección conferida por los anticuerpos presentes en la leche duró más que en la sangre.
Palabras clave: COVID-19, Leche materna, Vacunas, Anticuerpos, Anticuerpos neutralizantes.

RESUMO
Objetivo: Comparar o percentual de anticorpos neutralizantes para as variantes Wuhan e Omicron no leite e sangue de lactantes imunizadas contra o SARS-CoV-2 com base no número de doses e tecnologias de vacinas utilizadas. Métodos: Estudo transversal realizado em 2022 com 214 lactantes imunizadas para COVID-19 com as vacinas de mRNA, vetor viral não replicante ou virus inteiro inativo. Dados coletados via questionário padronizado e amostras de leite materno e sangue. Anticorpos detectados pelo método ELISA. Foi adotado um nível de significância de 5%. Resultados: O percentual de anticorpos foi maior no sangue do que no leite para as variantes Wuhan (sangue-91·3%/leite-23·1%) e Omicron (sangue-83·7%/leite–15·2%). Entre as mulheres com três ou mais doses, o sangue apresentou percentuais mais altos para as variantes Wuhan (mediana=91·9%) e Omicron (mediana=86·0%). No leite, embora não tenha sido encontrada disparidade no percentual de anticorpos, a probabilidade de presença de anticorpos foi maior do que no sangue para ambas as variantes. As tecnologias de vacinas levaram a diferenças significativas na presença de anticorpos no leite, mas não no sangue ao longo do tempo para a variante Omicron. Nenhuma diferença foi observada para a variante Wuhan. Conclusão: A proteção conferida pelos anticorpos no leite foi mais duradoura.
Palavras-chave: COVID-19, Leite materno, Vacinas, Anticorpos, Anticorpos neutralizantes.


INTRODUCTION

Debido al rápido aumento del número de casos confirmados y muertes en todo el mundo causadas por el SARS-CoV-21, se desarrollaron varias vacunas a partir de diferentes tecnologías2 y se probaron en ensayos clínicos3. Cuatro vacunas fueron aprobadas por la Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria (ANVISA) para su uso en Brasil: AstraZeneca, Janssen-Johnson & Johnson (vector viral no replicante), SinoVac/CoronaVac (virus SARS-CoV-2 entero inactivado) y Pfizer/BioNTech (ARNm)4,5. Aunque las mujeres embarazadas y lactantes no fueron incluidas en los ensayos clínicos de la vacuna, el Colegio Americano de Obstetras y Ginecólogos y el Ministerio de Salud de Brasil recomendaron la vacunación de este grupo6,7 basándose en artículos que confirman la seguridad de la vacuna tanto para las madres como para sus bebés8,9,10.
Dada la importancia de la leche materna para el sistema inmunitario de los lactantes, los estudios que examinan el impacto de la vacunación contra el SRAS-CoV-2 en los anticuerpos de la leche materna y la sangre destacan su importancia para el sistema inmunitario de los lactantes9,10. Perl et al.10 hallaron anticuerpos IgA e IgG significativos específicos del SRAS-CoV-2 en la leche materna tras la vacunación con ARNm, con fuertes efectos neutralizantes, lo que podría proteger a los lactantes. De forma similar, Gray et al9. observaron la presencia de IgG, IgA e IgM en el suero de mujeres vacunadas, detectándose anticuerpos en la leche materna de todas las participantes lactantes.
Varios estudios de diferentes países informaron de un aumento de anticuerpos neutralizantes contra el SRAS-CoV-2 en la leche humana tanto por vacunación como por infección previa con el virus. Algunos de ellos compararon diferentes tecnologías de vacunas11,12,13, otros evaluaron únicamente vacunas de ARNm8,10,14,15. También existen algunos estudios que compararon la presencia de anticuerpos neutralizantes en leche humana y sangre de mujeres lactantes vacunadas para COVID-19 (con o sin infección previa), considerando solamente vacunas de ARNm9,16,17,18 o vacunas de diferentes tecnologías19,20,21, sin embargo, no existen, hasta el momento, estudios que se hayan centrado en el análisis de anticuerpos neutralizantes provenientes de la vacunación basada en diferentes variantes del virus, especialmente en Brasil.
El objetivo de este estudio era comparar el porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante en la leche y la sangre de madres lactantes vacunadas contra el SRAS-CoV-2, centrándose específicamente en las variantes Wuhan y Omicron, en función del número de dosis y las tecnologías de vacunación utilizadas. Esto es crucial para comprender la inmunidad pasiva en los lactantes, especialmente porque la vacunación contra la COVID-19 aún no está disponible para los menores de seis meses en Brasil22, y el impacto sanitario global de la COVID-19 persiste.

MÉTODOS
DISEÑO DEL ESTUDIO, DATOS Y PARTICIPANTES
Este estudio transversal fue ampliamente divulgado entre las donantes y pacientes que asisten a las consultas de puericultura del Banco de Leche Humana del Instituto Nacional de Salud de la Mujer, del Niño y del Adolescente Fernandes Figueira (HMB-IFF/Fiocruz-RJ) y entre las madres lactantes fuera del IFF contactadas a través de las redes sociales con informaciones sobre los criterios de elegibilidad para participar del estudio, etapas y período de la investigación y datos de contacto para la programación, realizada a través de métodos de contacto en línea.
En este estudio se incluyeron mujeres en período de lactancia (exclusiva o no), mayores de 18 años residentes en Río de Janeiro que hubieran completado el curso de vacunación primaria con inmunizaciones contra COVID-19 disponibles en Brasil, con o sin dosis de refuerzo. Fueron excluidas las mujeres con volumen de leche inferior a 10 ml y aquellas con volumen de sangre inferior a 5 ml.
PROCEDIMIENTOS
Para la recolección de datos, se utilizó un cuestionario estandarizado y estructurado adaptado a esta investigación y probado previamente en un estudio piloto. Este instrumento administrado a través de “Google Forms” por investigadores capacitados incluía detalles sociodemográficos, información prenatal y clínica, estado nutricional, fechas de vacunación (primera, segunda y dosis de refuerzo) y fabricantes de las vacunas. Los datos se recogieron entre abril y octubre de 2022.
La recolección de leche tuvo lugar en el HMB-IFF/Fiocruz-RJ y fue realizada por investigadores previamente capacitados. Se utilizó una bomba eléctrica Medela para recolectar 10 ml de leche. Las muestras de leche fueron entregadas al Laboratorio de Alta Complejidad del IFF (LACIFF/Fiocruz-RJ), donde fueron centrifugadas a 2.000 revoluciones por minuto (rpm) a 4 °C durante 25 minutos, después de lo cual los sobrenadantes fueron envasados en frascos criogénicos y almacenados a -20 °C hasta su utilización. Antes de procesarlas, las muestras de leche materna se descongelaron y se centrifugaron a 2.000 rpm durante 15 minutos, se eliminó la grasa y se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo. La centrifugación se repitió dos veces para garantizar la eliminación de todas las células grasas.
Las muestras de sangre fueron recolectadas por profesionales entrenados en el Laboratorio de Nutrición del IFF/Fiocruz-RJ. Después de la colecta, las muestras fueron entregadas al LACIFF/Fiocruz-RJ, donde la sangre fue centrifugada a 3.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente, y los sueros fueron alicuotados en tubos Eppendorf de 2 ml y almacenados a -80 °C hasta su utilización.
Las pruebas fueron realizadas en el Laboratorio de Biotecnología y Fisiología de Infecciones Virales, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz-RJ (IOC/LABIFIV). Para detectar el porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante del SRAS-CoV-2 en las muestras de sangre y leche materna, se utilizó el método de ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) con el kit cPass™ SARS-CoV-2 Neutralization Antibody Kit (GeneScript). Esta prueba se diseñó para imitar la interacción del virus con el huésped mediante la interacción directa proteína-proteína en una placa de inmunoensayo enzimático directo (ELISA) utilizando el dominio de unión al receptor (RBD) purificado de la proteína de la spike y el receptor ACE2 de la célula huésped. Los anticuerpos neutralizantes en suero o leche pueden inhibir esta interacción, como en una prueba estándar de neutralización del virus. Esta prueba garantiza una especificidad del 100% y una sensibilidad del 93% para muestras por encima del umbral de inhibición del 30% (GenScript).
Las concentraciones se determinaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se diluyeron en el tampón proporcionado por el kit en placas de 96 pocillos hasta un volumen final de 100 µl. Las diluciones (10, 20, 50 o 100 veces) se adaptaron a las necesidades de cada muestra. A continuación, se añadieron 100 µl de la solución que contenía el dominio RBD del SARS-CoV-2 original (aislado de Wuhan) o de la variante Omicron (B.1.1.529) conjugado con peroxidasa (HRP). La placa se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se transfirieron 100 µl de cada pocillo que contenía la muestra y RBD-HRP a la placa de ensayo que contenía la molécula ACE2 humana. Las placas se incubaron durante 15 minutos a 37 °C, los pocillos se lavaron cuatro veces con 300 µl de la solución de lavado del kit y, a continuación, se añadieron 100 µl del sustrato 5-5′-tetrametilbencidina (TMB) durante 15 minutos de incubación en la oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo añadiendo 50 µl de solución de parada del kit, y la absorbancia se leyó a 450 nm. El cálculo de la proporción de anticuerpos con potencial neutralizante se realizó entonces mediante la siguiente ecuación, utilizando el control negativo del kit:

Fórmula

Los valores inferiores al 30% se consideraron negativos. El punto de corte se basó en paneles de validación de sueros de pacientes con COVID-19, en los que la presencia de anticuerpos neutralizantes se confirmó mediante la prueba de neutralización de reducción de placas al 50% (PRNT50) y un panel de sueros negativos. Los resultados se informan cualitativamente como positivos o negativos para la presencia de anticuerpos neutralizantes.
El método PRNT50 utiliza virus activo y se considera el patrón oro para la detección y cuantificación de anticuerpos neutralizantes que median en la inhibición viral. En comparación con los de un control de anticuerpos no neutralizantes, se ha informado de que los títulos de neutralización del virus en este ensayo dan lugar a una reducción del 50% en el número de placas23,24.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El almacenamiento de datos se realizó mediante hojas de cálculo Excel extraídas de “Google Forms”. Las variables categóricas se describen como frecuencias absolutas y porcentajes, mientras que las variables numéricas se presentan como medianas y rangos intercuartílicos (RIQ). Se utilizó la prueba de Wilcoxon emparejada para comparar el porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante en leche y sangre. La prueba de Mann-Whitney se utilizó para determinar si el porcentaje de estos anticuerpos variaba significativamente en función del número de dosis recibidas. Se utilizó la curva de Kaplan-Meier para determinar la probabilidad de presencia de anticuerpos a lo largo del tiempo utilizando el intervalo entre la última dosis de vacuna recibida y la recogida de leche/sangre. Para determinar si existían diferencias entre las curvas de Kaplan-Meier en función del material analizado y de la tecnología de la vacuna, se utilizó la prueba de rangos logarítmicos. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS, versión 22 y R, versión 4.0.3, con un nivel de significación del 5% (p < 0.05) como referencia.

RESULTADOS
La muestra del estudio estaba formada por 214 mujeres lactantes (Figura 1), de las cuales el 56,1% tenía 35 años o más; la mayoría eran de raza blanca (71%), vivían en pareja (93,9%), tenían estudios superiores incompletos/completos (92,1%) y habían recibido atención prenatal (99,5%). En cuanto al índice de masa corporal (IMC) previo al embarazo, el 38,3% de las mujeres tenían sobrepeso (sobrepeso/obesidad). En cuanto a las enfermedades crónicas, el 98,1% no tenía diabetes mellitus pregestacional ni hipertensión arterial sistémica (HAS) pregestacional. Cuando se les preguntó sobre la existencia de infección por SARS-CoV-2 antes de la vacunación, el 62,1% de las participantes confirmaron que ya habían dado positivo en la prueba de COVID-19 (Tabla 1).
Alrededor del cuarenta y siete por ciento (47,7%) de las mujeres recibieron la primera dosis de la vacuna de ARNm (Pfizer/BioNTech), el 33,6% recibieron la vacuna de vector viral no replicante (AstraZeneca o Janssen-Johnson & Johnson) y el 18,7% recibieron la vacuna de virus entero inactivado (SinoVac/CoronaVac). En cuanto a la segunda dosis, más de la mitad (58,4%) recibió la vacuna de ARNm (Pfizer/BioNTech), el 22,5% recibió la vacuna de vector viral no replicante (AstraZeneca o Janssen-Johnson & Johnson), y el 19,1% recibió la vacuna de virus entero inactivado (SinoVac/CoronaVac). La mayoría de las mujeres lactantes (93,5%) fueron vacunadas con tres o más dosis (considerando el ciclo completo de vacunación primaria y dosis de refuerzo) (Tabla 1).
Los análisis de anticuerpos en leche y sangre se realizaron en relación con las cepas variantes Wuhan y Omicron. El porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante fue mayor en sangre que en leche para ambas variantes: Wuhan - sangre (mediana = 91-3% AIQ [RIQ: 70-8-94-5%])/leche (mediana = 23-1% AIQ [RIQ: 12-8-34-0%]) (p < 0-001) (Gráfico 1a); y Omicron - sangre (mediana = 83-7% AIQ [RIQ: 51-2-93-8%])/leche (mediana = 15-2% AIQ [RIQ: 10-2-24-2%]) (p < 0-001) (Gráfico 1b).
No se encontró disparidad en el porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante en la leche entre las mujeres que recibieron dos dosis (mediana = 22-9% RIQ [12-8-44-9%]) y las que recibieron tres o más dosis (mediana = 23-5% RIQ [12-8-33-3%]) para la variante Wuhan (p = 0-578) (Gráfico 1c). En cuanto a los parámetros sanguíneos, el porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante fue notablemente mayor entre las mujeres con tres o más dosis (mediana = 91-9% RIQ [71-5-94-7%]) en comparación con aquellas con sólo dos dosis (mediana = 77-9% RIQ [45-6-92-2%]) (p = 0-018) (Gráfico 1d).
Para la variante Omicron, el porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante en la leche fue mayor entre las mujeres con dos dosis (mediana = 22-5% RIQ [20-1-27-9%]) en comparación con aquellas con tres o más dosis (mediana = 15-1% RIQ [10-5-22-8%]) (p = 0-334) (Gráfico 1e). En sangre, el porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante fue notablemente mayor entre las mujeres con tres o más dosis (mediana = 86-0% RIQ [52-4-94-0%]) que entre aquellas con sólo dos dosis (mediana = 63-0% RIQ [13-9-79-0%]) (p = 0.010) (Gráfico 1f).
La probabilidad de presencia de anticuerpos con potencial neutralizante fue mayor en la leche para ambas variantes en relación con el tiempo transcurrido entre la última dosis recibida y la extracción de sangre/leche. Para el análisis de la variante Wuhan, se observó un alto porcentaje de anticuerpos en los primeros 50 días posteriores a la vacunación (90% en leche y 80% en sangre). Sin embargo, la probabilidad de presencia de anticuerpos en la leche disminuyó en un 50% después de la vacunación. A los 200 días posteriores a la vacunación, se observaron reducciones sucesivas en los 20 días siguientes, estabilizándose la tasa de supervivencia en un 30%. En la sangre, se observó un descenso notable y constante, estabilizándose tras 200 días de vacunación, con sólo un 5% de probabilidad restante (Gráfico 2a). Asimismo, al analizar los anticuerpos frente a la variante Omicron, se observó un alto porcentaje en los 50 días iniciales tras la vacunación (100% en la leche y 80% en la sangre), con un descenso constante de la probabilidad de anticuerpos en sangre, que alcanzó el 50% a los 100 días y descendió a niveles mínimos (10%) a los 200 días posteriores a la vacunación. Por el contrario, la leche mostró un ligero descenso a los 100 días, permaneciendo estable con un 85% de probabilidad de presencia de anticuerpos hasta 190 días después de la vacunación (Gráfico 2b). En resumen, los anticuerpos en la leche proporcionaron una protección más duradera en comparación con la sangre, tanto para la variante Wuhan (p < 0.001) (Gráfico 2a) como para la variante Omicron (p < 0.001) (Gráfico 2b).
En los análisis de anticuerpos contra la variante de Wuhan, no se observaron diferencias significativas en la probabilidad de presencia de anticuerpos con potencial neutralizante a lo largo del tiempo cuando se analizaron diferentes tecnologías de vacunación, ni en leche (p = 0.900) (Gráfico 3a) ni en sangre (p = 0.800) (Gráfico 3b). En la leche, se observó una disminución del porcentaje de anticuerpos, que cayó hasta el 90% a los 15 días, para descender bruscamente hasta el 75% a los 50 días, persistiendo en este nivel durante los 200 días siguientes con la tecnología de virus entero inactivado. Con la tecnología de vectores virales no replicantes, el porcentaje de anticuerpos disminuyó a cerca del 75% entre los 50 y los 100 días, y volvió a descender al 60% a los 200 días posteriores a la vacunación. Con la tecnología de ARNm, el porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante disminuyó continuamente hasta el 45% después de hasta 180 días (Gráfico 3a). En la sangre, a los 50 días, hubo una disminución del 50% en el porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante, permaneciendo en el 20% después de 170 días con la tecnología de virus entero inactivado. En la tecnología de vector viral no replicante, este porcentaje era aproximadamente del 55% a los 90 días, disminuyendo constantemente con el tiempo, alcanzando niveles mínimos (10%) a los 200 días. Con el análisis de ARNm, el porcentaje de anticuerpos disminuyó continuamente a lo largo de 200 días, permaneciendo por debajo del 10% a los 240 días tras la vacunación (Gráfico 3b).
En el caso de la variante Omicron, se observaron diferencias significativas en la probabilidad de presencia de anticuerpos con potencial neutralizante a lo largo del tiempo en la leche (p < 0.001) (Gráfico 3c), pero no en la sangre (p = 0.700) (Gráfico 3d) al comparar las tecnologías vacunales utilizadas. En la leche, el porcentaje de anticuerpos se mantuvo estable en el 100% durante 40 días, tras lo cual descendió al nivel mínimo (10%) antes de alcanzar los 50 días posteriores a la vacunación mediante la tecnología de virus entero inactivado. En la tecnología de vector viral no replicante, la probabilidad de anticuerpos permaneció estable en el 100% durante unos 180 días, antes de descender a niveles inferiores al 10%. Con el análisis de ARNm, el porcentaje de anticuerpos disminuyó sutilmente, permaneciendo en niveles elevados (90%) durante más de 200 días después de la vacunación (Gráfico 3c). En cuanto al análisis de sangre, con la tecnología de virus entero inactivado, se observó una probabilidad de producción de anticuerpos de aproximadamente el 60% a los 50 días y del 20% a los 150 días de la vacunación, debido a los descensos sucesivos durante este periodo. Con la tecnología de vector viral no replicante, se observó una probabilidad de presencia de anticuerpos de aproximadamente el 75% a los 50 días de la vacunación, disminuyendo continuamente durante los 200 días siguientes hasta niveles inferiores al 10%. De manera similar, con la tecnología de ARNm, se observó una probabilidad aproximada del 80% de anticuerpos a los 50 días, disminuyendo a menos del 10% a los 250 días después de la vacunación (Gráfico 3d).

DISCUSIÒN
El estudio halló más anticuerpos con potencial neutralizante en la sangre que en la leche para las variantes Wuhan y Omicron. La presencia de anticuerpos varió con el tiempo, pero los anticuerpos de la leche proporcionaron una protección más duradera. A pesar de las disparidades metodológicas con Lechosa-Muñiz et al.25, donde todos los participantes no habían sido infectados previamente, los resultados fueron similares. En particular, el presente estudio no reveló diferencias significativas en el potencial de anticuerpos neutralizantes en la leche o la sangre en relación con la infección previa por COVID-19.
Lechosa-Muñiz et al.25 realizaron un estudio transversal en mujeres lactantes vacunadas con ARNm y vectores virales no replicantes. También observaron diferencias notables en la concentración sérica de IgG (p < 0-001) tras la vacunación, pero no en la concentración de IgG en la leche materna. De forma similar, Charepe et al.16 estudiaron a 24 mujeres profesionales sanitarias, analizando la leche humana de 14 participantes y el suero de toda la muestra tras la vacunación contra COVID-19 mediante la tecnología de ARNm, tres semanas después de la primera y la segunda dosis. Después de la segunda dosis, observaron un aumento de los niveles de IgG e IgM y una disminución de la IgA sérica. En la leche materna, los niveles de IgG aumentaron mientras que los de IgA disminuyeron tras la segunda dosis, sin que se detectara la presencia de IgM en ninguna de las dos dosis.
Además, el estudio descubrió que, tanto para la variante Wuhan como para la Omicron, las mujeres lactantes que recibieron sólo dos dosis tenían un porcentaje menor de anticuerpos con potencial neutralizante en sangre en comparación con las que recibieron tres o más dosis de diversos agentes inmunizantes utilizados en Brasil. En cuanto a la leche, no se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de anticuerpos contra la variante Wuhan; sin embargo, para la variante Omicron, se observó un mayor porcentaje de anticuerpos en la leche de las mujeres que recibieron sólo dos dosis en comparación con las vacunadas con tres o más dosis.
Rick et al.19 realizaron un estudio prospectivo de cohortes en el que analizaron la leche materna y la sangre de 45 mujeres antes y después de la dosis de refuerzo contra la COVID-19. De forma similar al presente estudio, observaron que el 96% de las participantes tenían anticuerpos en las muestras de sangre antes del refuerzo, con un aumento de las cantidades de dos a cuatro semanas después del refuerzo y sin reducción durante los días 60 a 119, permaneciendo consistentes con los niveles previos al refuerzo después de 120 días. En la leche materna, el 53% de las muestras eran positivas a los anticuerpos antes del refuerzo, observándose un aumento entre los 14 y los 35 días posteriores al refuerzo y un aumento continuo entre los días 60 y 119, lo que difiere de los resultados de la evaluación de la leche del presente estudio.
El estudio reveló un menor porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante para la variante Omicron en comparación con la variante Wuhan, tanto en la leche como en la sangre de mujeres lactantes vacunadas con dos dosis o tres o más dosis. Esto podría atribuirse a que las vacunas disponibles en Brasil durante el período de estudio no cubrían la variante Omicron, que fue identificada en Brasil sólo en noviembre de 202226,27. Además, la vacuna Comirnaty Bivalente Pfizer, recomendada para dosis de refuerzo contra las variantes del SRAS-CoV-2, incluyendo la Omicron, fue incorporada al esquema de vacunación apenas en febrero de 202328.
El estudio mostró un alto porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante tanto en sangre como en leche durante los 50 días iniciales tras la vacunación, disminuyendo gradualmente con el tiempo. En un estudio prospectivo con 29 mujeres lactantes, Kelly et al.14 observaron un aumento significativo de anticuerpos IgA e IgG en la leche materna tras la vacunación con el agente inmunizante ARNm de Pfizer-BioNTech. Los niveles de IgG permanecieron persistentes durante 20 a 40 días después de la primera dosis, con un posible descenso gradual de IgA a lo largo del tiempo después de la segunda dosis. Baird et al. 15, en un estudio longitudinal de cohortes de siete mujeres lactantes vacunadas con tecnología de ARNm contra la COVID-19, observaron un aumento de los niveles de IgA e IgG en el séptimo día después de la primera dosis. Hubo un descenso significativo antes de la segunda dosis, seguido de un aumento notable después de la segunda dosis, manteniendo niveles elevados 80 días después de la vacunación. Estos hallazgos subrayan la importancia de todas las dosis de la vacuna en el mantenimiento de anticuerpos con niveles potenciales neutralizantes en la leche materna y la sangre para la protección sostenida de las mujeres lactantes y sus hijos.
En cuanto al porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante en función de las tecnologías vacunales utilizadas, el estudio reveló diferencias en la probabilidad de detectar estos anticuerpos en leche y sangre para las dos variantes analizadas. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas para la variante de Wuhan.
Existen variaciones en las recomendaciones de la OMS respecto al intervalo entre dosis para las diferentes tecnologías de vacuna contra el SRAS-CoV-2. Para la tecnología de virus completo inactivado (SinoVac/CoronaVac), se recomienda un intervalo de dos a cuatro semanas (14 a 28 días)29; para la tecnología de vector viral no replicante, el intervalo recomendado es de ocho a doce semanas (56 a 84 días) para el inmunizador de AstraZeneca30 y de dos a seis meses (60 a 180 días) para el inmunizador de Janssen-Johnson & Johnson31 en el caso de una dosis única de refuerzo. En el caso de la tecnología de ARNm (Pfizer/BioNTech), el intervalo entre dosis debe ser de cuatro a ocho semanas (28 a 56 días)32. En cuanto a las dosis de refuerzo, para los grupos prioritarios, la recomendación es un intervalo mínimo de cuatro meses (120 días) después de la última dosis recibida28,33,34. De acuerdo con las recomendaciones, el presente estudio demostró que la disminución del porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante tanto en sangre como en leche se alinea con los intervalos de tiempo esperados para todas las tecnologías vacunales analizadas, sin comprometer la inmunidad de las mujeres lactantes.
El estudio reveló una reducción de los anticuerpos con potencial neutralizante a lo largo del tiempo tanto en la leche como en la sangre para las dos variantes de SARS-CoV-2 analizadas, independientemente de la vacuna utilizada. Curiosamente, la tecnología de virus completo inactivado experimentó un mayor descenso en los primeros 50 a 100 días posteriores de la vacunación, pero mantuvo niveles más altos de anticuerpos contra la variante de Wuhan en comparación con otros agentes durante los siguientes 150 a 200 días, especialmente en la leche. Por el contrario, la tecnología de ARNm mantuvo niveles de anticuerpos más altos que otros agentes durante los 150 días iniciales, pero mostró un descenso exponencial, a partir de entonces, alcanzando niveles más bajos que otras tecnologías.
En el caso de la variante Omicron, las tecnologías de vector viral no replicante y de ARNm mantuvieron porcentajes de anticuerpos más elevados durante los 200 días posteriores a la vacunación, especialmente en la leche, que la tecnología de virus completo inactivado, que disminuyó a niveles mínimos antes de los 50 días posteriores a la vacunación. Sin embargo, se recomienda precaución a la hora de interpretar estos resultados, ya que sólo tres mujeres lactantes de esta muestra recibieron la tecnología de virus completo inactivado para su última dosis. En consecuencia, la curva de Kaplan-Meier se basó únicamente en este pequeño número para esta tecnología de vacunación, lo que puede conducir a resultados inexactos, ya que este comportamiento no se observó para las otras tecnologías de vacunación analizadas.
Con base en esta evidencia y considerando la recomendación preferida para el uso de la tecnología de ARNm en Brasil para mujeres embarazadas y lactantes durante el período de recolección de datos de este estudio35, se confirmó la importancia de las dosis de refuerzo de acuerdo con el calendario de vacunación. Además, debido a esta recomendación, aunque el número de participantes inmunizadas con esta tecnología en este estudio fue mayor en todas las dosis que los otros agentes vacunales utilizados, fue importante evaluar el desempeño de los otros inmunizantes en el grupo analizado.
Aunque el porcentaje de anticuerpos con potencial neutralizante en la leche materna sea inferior al de la sangre, este estudio confirma la importancia de la leche materna para los lactantes como posible vía de adquisición de inmunidad pasiva, dado que en Brasil aún no se ha implantado la vacunación de los niños menores de seis meses22.
En cuanto a las metodologías empleadas para detectar y cuantificar los anticuerpos neutralizantes, la mayoría de los estudios sobre este tema han utilizado ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA) con diversos kits de análisis empleados. Aunque el ensayo PRNT50 se considera el patrón oro, necesita un virus activo similar al de la infección natural, por lo que es largo, caro y requiere instalaciones de bioseguridad de nivel 3 (BL3) y personal especializado, y está sujeto a variabilidad biológica. Por estas razones, elegimos el ELISA con el kit cPass™ SARS-CoV-2 Neutralization Antibody Kit (GeneScript), que no requiere instalaciones BL3, permite el análisis de varias muestras en menos tiempo y ofrece una mayor eficacia. Además, cuantifica anticuerpos con potencial neutralizante frente a antígenos relevantes del SARS-CoV-2, como la proteína S y el RBD24.
A diferencia de otros estudios publicados10,15,16,21,25, en este estudio no se compararon los diferentes isotipos de anticuerpos presentes en la leche materna y la sangre, ya que el objetivo era comparar el porcentaje total de anticuerpos con potencial neutralizante en función de las variantes, el número de dosis aplicadas y las tecnologías vacunales utilizadas, lo que dificulta las comparaciones entre los resultados disponibles.
Otro punto destacable es que, aunque el presente estudio se realizó durante la circulación de la variante Wuhan B.1.1.28 y B.1.1.3326,36, el análisis de anticuerpos también consideró la variante Omicron (líneas B.1.1.529 - BA.1, BA.1.1, BA.2) debido a su alta transmisibilidad26,27,37.
En resumen, la importancia del presente estudio se ve reforzada por el uso de datos de mujeres brasileñas inmunizadas con tecnologías vacunales aprobadas por la ANVISA, además de analizar anticuerpos con potencial neutralizante para dos variantes del SRAS-CoV-2.

AGRADECIMIENTOS
Los autores desean expresar su gratitud:
Todos los profesionales del Instituto Nacional de Salud de la Mujer, del Niño y del Adolescente Fernandes Figueira (IFF/Fiocruz-RJ) y del Laboratorio de Biotecnología y Fisiología de Infecciones Virales, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz-RJ (IOC/LABIFIV) que contribuyeron para la realización de este estudio.
Todos los profesionales voluntarios que participaron en la recolección de datos.
Todas las mujeres lactantes que participaron en la investigación.


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