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INTRODUÇÃO
Os carotenóides são o grupo mais disseminado de pigmentos na natureza, com mais de 600 estruturas químicas já caracterizadas (Fraser & Bramley1), entretanto apenas cerca de 50 deles possuem atividade biológica (Olson2). Esses compostos vêm despertando grande interesse em virtude de sua importância na prevenção de determinados tipos de câncer (como câncer de pulmão, mama, cavidade oral, cólon e reto), de doenças cardiovasculares e catarata, na ação inibidora nas mucosas contra úlceras gástricas e na atuação sobre o sistema imunológico.
O licopeno, um carotenóide com importante função fisiológica, é responsável pela coloração vermelho-alaranjada de frutas e hortaliças nas quais está presente. Esse carotenóide não tem atividade de provitamina A, mas tem um efeito protetor direto contra radicais livres, sendo considerado um potente antioxidante protetor da camada celular por reação com os radicais peróxidos e com o oxigênio molecular, principalmente (Moritz & Tramonte3). O β-caroteno, por sua vez, além de possuir atividade provitamina A, apresenta propriedades antioxidantes, protegendo o corpo contra certas doenças, retardando o envelhecimento, além de ser utilizado como corante natural para produtos alimentícios (Olson2).
A deficiência de vitamina A (DVA) é considerada um problema grave em mais de sessenta países. Em todo o mundo, estima-se que cerca de 4,4 milhões de pré-escolares sofram com os sinais clínicos da carência de vitamina A e que 127 milhões apresentem a deficiência na forma subclínica. Mesmo os inquéritos nacionais sendo escassos, no Brasil, a prevalência de DVA está estimada entre 16 e 74% em crianças menores de seis anos (West Jr4). Os inquéritos bioquímicos disponíveis no Brasil confirmam que a DVA é um problema de saúde pública nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Pernambuco, Paraíba, Bahia e Amazonas (Ramalho et al.5, 2002).
Dada a dificuldade de consumo dos produtos de origem animal devido ao seu custo mais elevado, as hortaliças e frutas contribuem com quantidades expressivas de provitaminas A para suprir a necessidade diária da vitamina. Hortaliças, como couve e tomate, podem ser produzidas praticamente durante todo o ano e sua aquisição é acessível para a maior parte da população. A couve (Brassica oleracea) destaca-se entre as hortaliças folhosas ricas em carotenóides devido a sua facilidade de produção e consumo em boa parte do território nacional (Campos6).
No Brasil, o tomate (Lycopersicom esculentum) é um dos alimentos mais consumidos, seja cru ou processado, por indivíduos de todas as classes sociais. Embora não seja considerado uma fonte rica de compostos pró-vitamina A, o tomate e seus produtos merecem atenção em termos de valor de vitamina A devido à facilidade de ser encontrado e de seus preços acessíveis. Por outro lado, é uma excelente fonte de licopeno. Uma vez que outros efeitos benéficos atribuídos aos carotenóides, tais como a prevenção do câncer e melhora da atividade imunológica, não são restritos aos precursores de vitamina A, todos os alimentos ricos em carotenóides, como o tomate, devem ser considerados (Campos6).
Devido à alta capacidade de oxidação dos carotenóides, o valor nutricional desses alimentos pode ser reduzido durante as diversas etapas a que são submetidos desde a colheita até a ingestão pelo consumidor (Bianchi & Antunes7). É de suma importância prever tais perdas e estabelecer medidas preventivas e critérios que possam ser adotados para minimizar o prejuízo nutricional tanto em domicílio, quanto em serviços de alimentação de coletividades.
Assim como os demais riscos que comprometem a qualidade dos alimentos, a perda do valor nutricional está relacionada à saúde dos consumidores e não é menos importante que as demais, embora suas conseqüências, potencialmente, só serão percebidas em médio e longo prazo. A utilização de boas práticas de manipulação no controle de perdas do valor nutricional pode ser de grande utilidade em Unidades de Alimentação e Nutrição (UAN). No entanto, é necessário estabelecer quais medidas podem ser tomadas para controlar a perda de vitaminas, sem ferir os critérios já estabelecidos para garantir a qualidade microbiológica (Campos6).
O propósito desse estudo foi avaliar procedimentos de manipulação, visando à validação de critérios relativos a medidas preventivas para o controle de perdas de carotenóides em hortaliças preparadas em uma UAN hospitalar, por meio da avaliação do conteúdo desses nutrientes após condições padronizadas de estocagem, preparo e distribuição.

MATERIAL E MÉTODOS
Material
Foram utilizados couve (Brassica oleracea, var. manteiga) e tomate (Lycopersicom esculentum, var. santa cruz) coletados em uma UAN hospitalar. As amostras de couve e tomate foram transportadas até o Laboratório de Análise de Vitaminas da Universidade Federal de Viçosa, embaladas em sacos plásticos, acondicionadas em isopor com gelo.

Reagentes e Outros Materiais
Para preparo das amostras utilizou-se reagentes com grau de pureza para análise (p.a.). Para filtração das amostras foram usados papel de filtro livre de cinzas Inlab, tipo 50, 9 cm de diâmetro; seringas descartáveis esterilizadas de 5 mL, da Plastipack 25 x 7, parede fina 22G1; unidades filtrantes HV Millex, em polietileno, 0,45 m de porosidade da Millipore, Brasil. Para preparação das fases móveis foram utilizados metanol da Tedia, USA; acetonitrila da Tedia, USA e acetato de etila OmniSolv da Mallinckroat Chemicals, USA, todos grau HPLC.

Métodos
UAN Colaboradora e Experimentos Realizados
Participou do estudo uma UAN hospitalar de médio porte, situada na cidade de Viçosa, MG. A rotina de manipulação das hortaliças foi analisada e registrada através de formulários previamente estabelecidos.
Experimento 1 – Nesta fase, foi testado o efeito do armazenamento por 24 horas em temperatura de refrigeração (10°C), seguido da imersão em solução sanitizante por 15 minutos, sendo realizada análise do conteúdo de carotenóides após cada uma dessas etapas. Amostras representativas de cada hortaliça foram coletadas, armazenadas em sacos plásticos, identificadas e acondicionadas em isopor com gelo para o transporte até o laboratório.
Experimento 2 – Nesta fase, foram analisados os efeitos das condições de sanitização por 15 minutos e distribuição imediatamente após o preparo. O tomate também foi coletado 60 e 120 minutos após o preparo e a couve refogada, 30 e 60 minutos após o preparo, para verificar se os tempos reais utilizados na UAN acarretariam perdas significativamente maiores quando comparadas aos critérios utilizados. As amostras foram coletadas após cada uma das etapas descritas (coleta 1: após sanitização; coleta 2: logo após o preparo; demais coletas: após cada um dos tempos de espera). Como a freqüência de couve no cardápio era reduzida, somente a couve refogada teve suas concentrações de carotenóides avaliadas.
O grupo controle consistiu nas amostras de couve e tomate que não sofreram nenhum tipo de tratamento (armazenamento, sanitização ou preparo).
O experimento foi realizado com três repetições, em diferentes dias, sempre respeitando a freqüência das hortaliças no cardápio da UAN.
Extração e Análise de Carotenóides
A extração e análises das amostras foram realizadas com as luzes apagadas, tomando-se o cuidado de proteger os pigmentos da luz e do oxigênio, usando papel alumínio para cobrir as vidrarias, frascos de vidro âmbar e cortinas do tipo “black-out”.
O processo de extração foi realizado baseando-se no procedimento descrito por Rodriguez at al8, com algumas modificações: foram pesados cerca de 5 gramas de tomate e 3 gramas de couve; logo após, foram adicionados em torno de 70 mL de acetona resfriada à amostra, que foi triturada em microtriturador. Para as amostras de couve crua, foi utilizado um passo adicional, descrito por De Sá & Rodriguez-Amaya9, que consistiu na utilização de um banho em vibrador ultrassônico, para facilitar a extração dos carotenóides, durante 20 minutos. O material foi filtrado a vácuo em funil de büchner utilizando-se papel de filtro. A extração com acetona foi repetida até o resíduo do filtro se tornar incolor. Em amostras de couve cuja preparação foi refogada, foi utilizado, com modificações, o procedimento sugerido por De Sá & Rodriguez-Amaya9, que consistiu na solidificação do óleo em congelador por um período de 2 horas após a trituração. Em seguida, o filtrado foi transferido, aos poucos, para um funil de separação, onde foram adicionados 50 mL de éter de petróleo resfriado, para que ocorresse a transferência dos pigmentos da acetona para o éter. Cada fração foi lavada com água destilada 3 vezes, para retirar toda a acetona.
A concentração do material foi feita da seguinte maneira: acrescentou-se sulfato de sódio anidro ao éter de petróleo para retirar qualquer resíduo de água que, porventura, tivesse restado e que pudesse prejudicar a evaporação do material; a evaporação do extrato em éter de petróleo foi feita em evaporador rotativo na temperatura de 33°C; os pigmentos foram, então, redissolvidos em quantidade conhecida de éter de petróleo (balão volumétrico de 25 mL) e armazenados em frascos de vidro âmbar em congelador, até a análise dos carotenóides.
O material obtido da extração de pigmentos foi utilizado na realização das análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Uma alíquota (2mL) do extrato armazenado em éter de petróleo foi evaporada sob fluxo de nitrogênio e, em seguida, recuperada em quantidade conhecida de acetona. O extrato foi, então, filtrado em unidade filtrante HV Millex e injetado na coluna cromatográfica para análise. As condições cromatográficas, utilizadas de acordo com Pinheiro-Sant’Ana10, com algumas modificações foram: cromatógrafo líquido de alta eficiência, Shimadzu, munido de bomba de alta pressão, modelo LC-10AT VP; injetor automático com “loop” de 50L, modelo SIL-10AF; detector de arranjo de diodos UV-Visível, modelo SPD-M10A; software “Multi System” modelo Class VP 6.12, para controle de até 4 sistemas; coluna Phenomenex C18, 250 x 4,6 mm; 5 µm; fase móvel composta de metanol: acetato de etila: acetonitrila (50:40:10); fluxo: 1,5 mL/minuto; tempo de corrida de 9 minutos. Os cromatogramas foram lidos a 450 nm. As análises e pós-análises foram controladas por um computador acoplado ao sistema.

Preparo das Curvas Padrão, Identificação e Quantificação de Carotenóides
Para construção da curva pardrão de β-caroteno, após a quantificação em espectrofotômetro, foram injetados 5 e 10L de uma solução de 5g/mL; 20, 30 e 50L de uma solução de 10g/mL; 50L de uma solução de 20g/mL e 50L de uma solução de 40g/mL de β-caroteno (Sigma, USA). Para a curva padrão de licopeno, utilizou-se como padrão o pigmento extraído de tomate, separado por cromatografia de coluna aberta e quantificado por espectrofotometria. Foram injetados 15, 30 e 50L de uma solução 7,88 g/mL e 30 e 50 L de uma solução 1,97 g/ mL de licopeno.
A identificação dos componentes nas amostras de hortaliças foi feita comparando-se os tempos de retenção obtidos para os padrões e para as amostras, analisados sob as mesmas condições. Além disso, foram comparados os espectros de absorção dos padrões e dos picos de interesse nas amostras, utilizando o detector de arranjos de diodos.
A partir das curvas padrão obtidas, foi calculada a concentração dos compostos presentes nas amostras. O valor real da concentração nas amostras foi obtido pelos cálculos das diluições realizadas.

Cálculos
As porcentagens de retenção de β-caroteno e licopeno foram calculadas de acordo com a equação: 100 – [(conteúdo inicial - conteúdo final) / conteúdo inicial x 100], em que o conteúdo inicial corresponde à amostra controle (antes de qualquer manipulação) e o conteúdo final às amostras após todas as etapas de manipulação.
Para que pudessem ser realizadas comparações entre as quantidades reais de β-caroteno e licopeno na couve crua e refogada, as porcentagens de retenção real dos compostos foram calculadas de acordo com a técnica proposta por Murphy et al., citado por De Sá & Rodriguez-Amaya9, utilizando a seguinte equação:
%RR = conteúdo do composto por grama de alimento cozido x peso em grama do alimento cozido x 100
conteúdo do composto por grama de alimento cru x peso em grama do alimento cru
Onde RR= retenção real

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Procedimentos Operacionais Utilizados pela UAN
A partir das observações do processo de produção das hortaliças estudadas, evidenciou-se a presença de condições que provavelmente estariam contribuindo para a perda de carotenóides, como: transporte inadequado das hortaliças até a UAN; falhas durante o processo de sanitização (as hortaliças não ficavam completamente submersas na solução); manutenção das hortaliças em temperatura ambiente após o preparo; e o grande intervalo de tempo entre o preparo e a distribuição (Quadro 1).
QUADRO 1

Análises Qualitativas
O perfil cromatográfico obtido para β-caroteno e licopeno mostra uma eficiente separação, indicando que a quantificação dos teores nas amostras foi realizada de forma confiável (Figura 1).
FIGURA 1
Análises Quantitativas
O conteúdo de β-caroteno e licopeno nas amostras relativas ao armazenamento e à sanitização (experimento 1) não apresentou diferença estatisticamente significativa em relação ao controle, em ambas as hortaliças estudadas (Tabela 1). Os valores de retenção foram elevados, o que demonstra que os critérios sugeridos para estocagem e sanitização parecem ter minimizado as perdas de β-caroteno e licopeno que poderiam estar ocorrendo com as condições operacionais utilizadas como rotina. Os teores de licopeno variaram entre 1074,26 e 1576,14 μg/100g e os de β-caroteno entre 625,82 e 661,33 μg/100g em tomate. A variação do conteúdo de carotenóides em tomates está intimamente relacionada à variedade e ao grau de maturação, já que são esses os principais pigmentos responsáveis pela alteração de cor durante o amadurecimento (LOIS et al.9). Campos6, ao testar a influência da temperatura de armazenamento e o tempo de sanitização nos teores de licopeno e β-caroteno em tomates, não verificou diferenças estatisticamente significativas no conteúdo quanto ao tipo de estocagem (em temperatura ambiente ou sob refrigeração) nem quanto ao tempo de sanitização. No presente trabalho, o armazenamento por 24 horas sob refrigeração e a imersão em solução sanitizante também não influenciaram significativamente os teores e as retenções de licopeno e β-caroteno dos tomates. Em couve, o conteúdo de β-caroteno variou entre 5124,94 e 5838,32 μg/100g, sem diferenças significativas quanto ao armazenamento e à sanitização.

TABELA 1

A Tabela 2 mostra os resultados obtidos para o experimento 2. Primeiramente, analisou-se o efeito do armazenamento seguido de sanitização sobre a amostra controle, que não sofreu tratamentos. Os tempos de espera até a distribuição (0, 60 e 120 minutos para o tomate e 0, 30 e 60 minutos para a couve) foram comparados à amostra obtida após armazenamento e sanitização. Os teores de licopeno variaram entre 600,11 e 1297,31 μg/100g e os de β-caroteno entre 631,24 e 759,54 μg/100g em tomate. Em couve, os conteúdos de β-caroteno variaram entre 4856,22 e 7409,20 μg/100g.
Campos6 observou que o tipo de corte e o tempo de exposição para consumo não interferiram no conteúdo de β-caroteno em tomates, não sendo possível determinar quais práticas de manipulação seriam mais indicadas para o fatiamento e a distribuição para consumo. Apesar disso, sabe-se que o aumento do tempo e da superfície de exposição ao oxigênio e a luz podem elevar as perdas de nutrientes em alimentos. Desta forma, recomenda-se principalmente reduzir o tempo entre o preparo e o consumo.
Observa-se que não houve diferença estatisticamente significativa entre os conteúdos de β-caroteno e licopeno nas hortaliças estudadas durante as diferentes etapas de manipulação, quando comparadas ao controle (Tabela 2). Ressalta-se que, mesmo durante o processo de cocção da couve, as perdas, em termos de conteúdo, não foram observadas. Entretanto, quando se analisa a retenção de β-caroteno em couve, verifica-se que apenas 68,2% de seu conteúdo inicial foi preservado após 60 minutos de exposição. Em tomate, ao contrário, as perdas foram bastante reduzidas: após 120 minutos de espera até a distribuição, 91,96% do conteúdo inicial de β-caroteno foi preservado, possivelmente devido ao fato de a casca do tomate ter exercido efeito protetor, evitando possíveis perdas para o meio.

TABELA 2
Nesse estudo, para as amostras de couve cuja preparação foi refogada, utilizou-se o procedimento sugerido por De Sá & Rodriguez-Amaya9, que consistiu na solidificação do óleo e sua retirada, visando à substituição da saponificação e reduzindo as chances de perdas durante a extração. Alguns estudos têm realizado a saponificação em certos tipos de amostras para hidrolisar ésteres de carotenóides e remover interferentes, como clorofilas (Granado et al.10; Hart & Scott13; Lessin et al.14). Na maioria dos casos a saponificação resulta em perda de carotenóides (Granado et al.12). Segundo Hart & Scott13, para amostras com alta concentração de lipídios a saponificação pode exigir condições mais drásticas, o que pode causar perda dos carotenóides em estudo.
Vários autores têm descrito perdas de carotenóides, quando as amostras são submetidas a diferentes processos culinários (Granado et al.12). Sabe-se que o tempo e a temperatura de cocção podem causar degradação dos carotenóides (Pinheiro-Sant’ana10).
Entretanto, ainda há divergência na literatura sobre os efeitos do cozimento sobre o teor de carotenóides de vegetais. Alguns autores mostram que o cozimento pode causar perda (Godoy & Rodriguez-Amaya15), enquanto outros estudos encontraram resultados opostos, em que as perdas foram inexistentes ou houve aumento dos teores (Granado et al.12; Hart & Scott13; Lessin et al.14). Este aumento tem sido atribuído a uma maior eficiência na extração devido ao fato do tratamento térmico inativar enzimas oxidativas e desnaturar os complexos carotenóide-proteína existente nas células vegetais (Lessin et al.14).
Alguns estudos têm mostrado que a biodisponibilidade de carotenóides em vegetais pode aumentar com o processamento (Rock et al.16). Hof et al.17 revisaram dados sobre o efeito do processamento de vegetais sobre a biodisponibilidade de carotenóides e concluíram que o tratamento térmico pode aumentar a biodisponibilidade. Assim, é possível que, mesmo havendo perdas significativas após o processamento, os carotenóides que se mantëm sejam melhor absorvidos. O licopeno, por exemplo, tem sua biodisponibilidade aumentada com o processamento, devido à liberação da matriz do alimento. Com isso, molho de tomate e purê de tomate são tidos como melhores fontes biodisponíveis de licopeno do que as demais fontes de alimentos não cozidos, tais como o tomate cru (Moritz & Tramonte4).
Utilizando o fator de conversão para β -caroteno recomendado pelo IOM18, em que 12 μg de β-caroteno equivalem a 1 Equivalente de Atividade de Retinol (RAE), pode-se calcular o valor de vitamina A das hortaliças estudadas. Uma porção de 100 g de tomate analisado nesta pesquisa fornece 56 μg de retinol, equivalentes a 9% e 11% das necessidades diárias para homens e mulheres adultos, respectivamente. Já uma porção de 100 g de couve fornece em média, 494 μg de retinol, correspondentes a 80% das necessidades diárias de homens e 92% das necessidades diárias de mulheres (IOM18).

CONCLUSÃO
Para a manipulação de couve e tomate em UAN, recomenda-se o armazenamento em temperatura de refrigeração, imersão em solução sanitizante pelo tempo recomendado pelo fabricante (15 minutos) e distribuição imediatamente após o preparo.
Os critérios avaliados na UAN Hospitalar contribuem para controlar as perdas de carotenóides nas hortaliças, uma vez que, de maneira geral, a retenção dos componentes foi elevada. Sugere-se a adoção dos critérios utilizados em outras UAN.

CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES
CM Della Lucia trabalhou na pesquisa e na metodologia; FM Campos, na concepção do projeto e nas análises estatísticas; GMSC Mata, na metodologia e HM Pinheiro-Sant’Ana, na concepção do projeto, na orientação e na revisão final do artigo.

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AGRADECIMENTOS
Ao PIBIC/CNPq/UFV, pelo apoio financeiro.