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INTRODUÇÃO
Com o aumento da industrialização, os trabalhadores estão freqüentemente expostos a agentes químicos, físicos e biológicos, que podem ter um efeito mutagênico e carcinogênico nas populações 1, 2.
Os solventes industriais são muito numerosos e em algumas áreas de trabalho são a principal fonte de risco para os trabalhadores. Sua utilização pode ser muito variável, isso é, um mesmo composto pode ser destinado como solvente, diluente e reativo a produtos intermediários em processos de síntese orgânica 3.
Na fabricação de calçados este elemento esta presente como fator de risco em todo o fluxo tecnológico, e a elaboração deste é utilizado em diferentes substâncias químicas que contém nafta, tolueno, metil-etil-cetona, cola, e outros, nas diferentes fases do processo da confecção do produto final 3. Segundo Burgaz et al. 4, o n-hexano e o tolueno são os solventes encontrados com maior freqüência nas colas usadas nos sapatos, mas existem outros solventes como o heptano, acetona e benzeno que tem menor concentração.
Desde que se soube que o benzeno pode causar leucemia em humanos e outros efeitos adversos a saúde, foi substituído em grande parte por outros solventes menos tóxicos. Entretanto, em muitas partes do mundo alguns processos industriais ainda fazem uso controlado do benzeno ou usam-no em uma mistura, por exemplo, em gasolina e como o solvente adesivo em fábricas de colagem e de sapato, sendo que a população geral é exposta ao benzeno das emissões automotrizes 5.
A exposição ao benzeno pode ser avaliada com o uso de biomarcadores que são úteis em caracterizar a exposição interna, como por exemplo, o benzeno não metabolizado na respiração, na urina e no sangue ou como metabólitos na urina. Mas os marcadores com potenciais carcinogênicos, como por exemplo, os citogenéticos, são também muito importantes 5.

Os trabalhadores em fábricas de sapatos e botas são expostos a uma mistura de solventes orgânicos, particularmente o tolueno, mas também a outros compostos principalmente originários da cola usada. O tolueno aparentemente não é um carcinógeno, nem genotóxico in vitro, e não apresentam respostas positivas em ensaios in vivo, os quais sugerem que na exposição ao tolueno não resultam danos genéticos nas células somáticas. Por outro lado, o benzeno pode ser responsável por algum tipo de câncer, como por exemplo, a leucemia que é encontrada em trabalhadores da indústria de botas e de sapato. Investigações recentes indicam que há uma freqüência aumentada de aberrações cromossômicas estruturais em trabalhadores de sapatarias expostos ao benzeno e ao tolueno 6.
Com o aumento de estudos que documentam a existência de xenobióticos perigosos por todo o mundo 7, 8, 9, e com o aumento da introdução, no ambiente, de agentes químicos fabricados pelo homem, a população e as agências governamentais estão se tornando cada vez mais preocupadas com o impacto de contaminantes ambientais para as populações humanas. Para diminuir essas preocupações, as populações expostas estão sendo monitoradas a fim de determinar se uma exposição pode ou não causar problemas na saúde 10.
Uma maneira de se estudar os efeitos em uma população exposta é conduzir estudos de monitoramento, utilizando parâmetros biológicos pertinentes, com manifestação a curto prazo, tais como, ensaios de micronúcleos, que podem identificar danos no DNA e/ou nos cromossomos resultantes da exposição ocupacional. A informação obtida pode ser usada como um aviso precoce do risco potencial para desenvolver a longo prazo problemas de saúde 11.
Micronúcleos consistem em pequenas quantidades de DNA que surgem no citoplasma quando fragmentos de cromossomos ou cromátides ou cromossomos inteiros que não são incorporados ao núcleo principal da célula filha, por ocasião da divisão celular. Fragmentos acêntricos não migram e permanecem atrasados na anáfase, enquanto que os elementos cromossômicos com centrômero são orientados em direção aos pólos do fuso. Os fragmentos de DNA deixados para trás são incorporados dentro de núcleos secundários, que por serem muito menores que o núcleo principal da célula são chamados de micronúcleos. As células esfoliadas não se dividem mais, mas refletem anormalidades citogenéticas que ocorreram na população de células da camada basal. A determinação de micronúcleo dá-se de método rápido e não invasivo, nos casos de mucosa bucal, escarro, urina, sêmem, colo uterino. A presença de micronúcleos nas células esfoliadas serve como dosímetro interno indicando um potencial ao desenvolvimento de câncer. A aplicação da pesquisa de micronúcleos em estudos populacionais com diferentes exposições genotóxicas pode aumentar o conhecimento do potencial carcinogênico de agentes ambientais em humanos e pode permitir elucidar mecanismos carcinogênicos 12.
Esse trabalho teve por objetivo investigar a freqüência de células com micronúcleos (CMN), núcleos ligados (CNL), binucleadas (CBN) e total de anomalias (TA) em células esfoliadas da mucosa bucal de trabalhadores de sapatarias, visando detectar se há efeito genotóxico das substâncias a que eles estão expostos. Além disso, avaliar a influência de fatores não ocupacionais, como idade, tempo de trabalho, uso de fumo e hábito alcoólico, doenças dermatológicas, oftalmológicas e respiratórias na freqüência de células com micronúcleos e demais alterações. E intervir, se for o caso, afim de reforçar a necessidade do uso de equipamento de proteção, para de diminuir o nível de exposição a que os trabalhadores são submetidos no ambiente de trabalho.
MÉTODOS
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Genética da Escola de Saúde da Universidade Católica de Pelotas, sendo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa desta instituição. A amostra analisada constou de 108 trabalhadores, destes, 54 eram trabalhadores de sapatarias, os quais estão diariamente expostos a substâncias químicas como cola e solventes, e 54 trabalhadores denominados grupo controle, os quais atuam em diferentes áreas e sem exposição conhecida a agentes genotóxicos de qualquer origem, apresentando mesmo sexo, mesma faixa etária e mesmo nível sócio-econômico do grupo exposto.
Ambos os grupos de trabalhadores responderam a um questionário, conforme protocolo publicado pela Comissão Internacional para Proteção Ambiental a Mutágenos e Carcinógenos 13, para a obtenção de informações quanto à exposição ocupacional, não ocupacional, hábitos e dieta. E assinaram um termo de consentimento pós-informado.
O material necessário para análise foi obtido através de coletas realizadas com o auxílio de um abaixador de língua de madeira, previamente umedecido em água mineral sem gás. Foi feito a raspagem na cavidade oral, na região malar, para obtenção de células esfoliadas da mucosa bucal. A primeira raspagem foi desprezada. O abaixador de madeira, com o raspado foi colocado em tubo de centrífuga com tampão fosfato, pH 6,8. O material foi, então, transportado até ao Laboratório, onde foi processado.
Foram retirados os abaixadores de madeira dos tubos e os mesmos foram centrifugados, durante dez minutos a 1.000 rpm, retirando-se o sobrenadante e deixando-se 0,5 ml de sedimento e solução. Após, foi colocado 12 ml de fixador (metanol; ácido acético 3:1) por 30 minutos, no freezer, centrifugando-o novamente. Ao retirar o sobrenadante, foi deixado 0,5 ml, adicionando-se mais uma vez 8 ml de fixador. Logo, a solução foi centrifugada, retirando-se após, o sobrenadante, deixando-se o mínimo de solução (0,3 ml). Com o auxílio de uma pipeta Pasteur, a solução foi ressuspendida, pingando-se na lâmina pré-aquecida a 37°C, 3 gotas, levando-se até a chama de uma lamparina, flambando e deixando secar por toda a noite. Na manhã seguinte, realizou-se a hidrólise com HCl (1N) a 63°C e corou-se com Shiff-fast-green por 10 minutos.
A análise das células foi realizada em microscópio óptico, binocular, com objetiva de 100X. A freqüência de micronúcleos (Figura 1) e outras anomalias nucleares (células com núcleos ligados e células binucleadas) foram registradas em ficha específica. Foram analisadas 2.000 células por indivíduo, considerando-se somente as células não fragmentadas e não sobrepostas. Os critérios utilizados para a identificação de um micronúcleo foram os estabelecidos por Picker e Fox 14: (a) o micronúcleo deverá ter um contorno regular, redondo ou oval e estar dentro do citoplasma de uma célula; (b) o micronúcleo deve ser Feulgen-positivo e de intensidade igual ou menor, a mesma textura e refração do núcleo principal; (c) o micronúcleo deve ser menor que o núcleo principal, isto é, seu diâmetro deve ser 1/3 do diâmetro do núcleo principal; (d) estar no mesmo plano de foco; e (e) o micronúcleo deverá estar claramente separado do núcleo principal. Serão registrados até três micronúcleos por célula, sendo que, micronúcleos questionáveis não serão registrados.
Os dados foram codificados, tabelados e armazenados em um banco de dados do programa SPSS, “for Windows”, versão 10.0, e as análises estatísticas foram realizadas através do teste de Mann-Whitney U, com significância p<0,05.
RESULTADOS
As principais características da população estudada estão resumidas na Tabela 1. A média da idade dos dois grupos não foi significativamente diferente, o tempo de trabalho variou de 0,1 a 50 anos, a renda familiar de 1 a 15 salários. As demais doenças como as oftalmológicas, respiratórias e sistema nervoso central (SNC) encontrava-se na mesma proporção nos expostos e nos controles.
Na Tabela 2 constam os dados das alterações nucleares observadas. A média destas alterações constou de 8,69+6,49 de TCMN, 8,85+4,92 de TCBN, 5,78+4,78 de TCNL, 23,31+10,01 de TA nos expostos, já nos controles o TCMN foi de 4,00+5,05, o TCBN foi de 4,63+4,35, o TCNL foi de 4,76+5,00 e o TA foi de 13,39+9,43, todos elas apresentaram p significativo de 0,0001 exceto o TCNL que foi p=0,144.
Procurou-se investigar a influência dos fatores não ocupacionais no número de células com alterações nucleares (TCMN, TCBN, TCNL e TA), tanto nos sapateiros como nos controles (Tabela 3 e 4).
Nos trabalhadores expostos não houve diferenças significativas entre o número de células com micronúcleos, binucleadas e com núcleos ligados, entretanto, verifica-se um pequeno aumento de células com micronúcleos concomitante ao aumento da faixa etária.
O tempo de trabalho foi classificado em três faixas (1: de 0,1 a 10 anos; 2: de 11 a 21 anos e 3: de 22 a 72 anos) e observou-se que o número de células com micronúcleos foi maior nas faixas extremas 1 e 3 que diferiram significativamente da faixa 2. A renda familiar, também foi dividida em três faixas (1: de 0 a 1 salário; 2: de 2 a 4 salários; 3: de 5 a 15 salários) e embora observe-se uma diminuição do número de CMN conforme aumenta o número de salários, esta diferença não foi significativa.
O sexo, o hábito de beber, o hábito de fumar e as doenças respiratórias, oftalmológicas, sistema nervoso central e dermatológicas não influenciaram no número de células com alteração nucleares. O mesmo ocorreu com os controles, em que os fatores não ocupacionais não inferiram no número de alterações nucleares.
DISCUSSÃO
A exposição a agentes genotóxicos pode ser natural e ambiental, por contaminação não específica ocupacional ou por acidentes industriais 15.
Os sapateiros são trabalhadores informais que estão expostos a substâncias presentes na cola, na tinta e no solvente usado no concerto dos sapatos, que contêm hexano, acetona e benzeno. Os vapores destes produtos ficam no ambiente e chegam ao trabalhador por distintas vias de entrada, o que ocasiona irritação nas vias respiratórias superiores e afetam o nariz, a garganta e os pulmões. Em contato com a pele podem causar ressecamento e irritação. Estas substâncias são potencialmente tóxicas para o fígado principalmente quando combinadas, podem também ser prejudiciais para os rins, coração e sistema nervoso central podendo causar sonolência, dor de cabeça, tontura, dispepsia e náuseas 3. Burgaz et al. 4 demonstram em seu trabalho que o hexano é a principal substância a que estes trabalhadores estão expostos.
Diaz et al. 16 observaram um aumento significativo na freqüência de micronúcleos em células da mucosa oral de cubanos, expostos principalmete ao xileno ao tolueno. Surralles et al. 17 sugeriram que o nível de exposição ao benzeno de ~1.p.m.m. não induz aumento significativo da freqüência de micronúcleos em células de mucosa bucal de linfócitos, mas o tolueno tem sido considerado genotóxico tanto in vivo como in vitro 4.
Os resultados deste trabalho, que mostram uma freqüência significativamente aumentada de CMN e outras alterações nos trabalhadores de sapataria em relação ao controle, concordam com os resultados de Burgaz et al. 4, que também avaliou a freqüência de micronúcleos em células esfoliadas da mucosa bucal de sapateiros na Turquia.
Poucos são os trabalhos que relatam estudos com este tipo de trabalhador. Um outro estudo realizado por Padrón et al. 5, avaliou a morbidade de sapateiros através de exame clínico e laboratorial. Nesse trabalho foram investigados 58 mulheres e 13 homens, trabalhadores de sapatarias que foram comparados com um grupo controle de 133 pessoas. Tendo em vista que os resultados indicam uma maior morbidade entre os expostos, os autores recomendam estabelecer uma vigilância de saúde nestes trabalhadores.
Em contrapartida, Pitarque et al. 6, realizaram avaliação genotóxica em 34 mulheres que trabalhavam em fabricas de sapato, através de ensaio cometa e não achavam aumento significativo de genotoxidade nas mulheres expostas avaliadas.
O fumo tem sido uma das principais causas de câncer de bexiga e muitos trabalhos mostram um aumento de micronúcleos em fumantes. A bebida alcoólica também tem sido descrita como uma substância mutagênica 2, entretanto neste trabalho ficou evidenciado que nem o fumo e nem o álcool causaram aumento de células com micronúcleos nem entre os expostos nem entre os controles.
Alguns estudos mostram uma associação positiva entre a idade e freqüência de micronúcleos, devido ao significante aumento nas alterações cromossômicas, tanto em homens como mulheres, com o aumento da idade 18. Por essa razão, avaliou-se a influência de três faixas etárias no número de CMN. Embora as diferenças não tenham sido significativas, verifica-se um pequeno aumento de CMN relacionado com o aumento de idade, o que confirma os estudos anteriores.
Os demais fatores não ocupacionais analisados não influíram no número de CMN, portanto, apenas a exposição a substâncias tóxicas utilizadas no trabalho dos sapateiros causam um aumento nas alterações nucleares.
Procurou-se confirmar através do questionário de saúde pessoal, se as alterações dermatológicas (dermatite, problemas cutâneos, ardência, manchas ou alteração da pigmentação, coceira, edema inchaço e outros) oftalmológicas, respiratórias (asma, bronquite, falta de ar, tosse crônica, rinite, sinusite e coceira no nariz) e do sistema nervoso central (tonturas, cansaço metal, dor de cabeça e outros), relatadas pelos trabalhadores de sapatarias, realmente apresentavam uma alta freqüência entre eles. E constatou-se que na realidade esses problemas encontram-se na mesma proporção tantos nos expostos quanto nos controles e não apresentaram relação com o número de células com alterações nucleares.
Pode-se concluir, portanto, que os trabalhadores de sapataria expostos a uma mistura de solventes orgânicos, avaliados neste trabalho, apresentam um aumento significativo de TCMN, TCBN e TA indicando uma ação genotóxica destas substâncias e que os fatores não ocupacionais não têm relação com este aumento.

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